Biochemische Labormethoden: Arbeitsvorschriften Und Tabellen

ISBN-13: 9783540192671 / Niemiecki / Miękka / 1988 / 240 str.

Martin Holtzhauer

Opis

In dem vorliegenden Buch werden biochemische Methoden und Stoffdaten zusammengestellt, die f}r grundlegende Arbeits- techniken h{ufig ben-tigt werden. Durch die Orientierung auf die Laborpraxis wurde zugunsten einer bersichtlichkeit auf theoretische Er-rterungen verzichtet. Das Methodenspektrum reicht von quantitativen Bestimmungen }ber analytische und pr{parative Trennverfahren bis zu immunchemischen und Nukleins{ure-Sequenzanalyse-Methoden.

Spis treści

1 Quantitative Methoden.- 1.1 Quantitative Proteinbestimmungen.- 1.1.1 Proteinbestimmung nach Lowry u. Mitarb.- 1.1.2 Proteinbestimmung nach Lowry u. Mitarb in Gegenwart störender Begleitsubstanzen.- 1.1.3 Proteinbestimmung nach Bradford.- 1.1.4 Proteinbestimmung in Probenlösungen für die SDS-Gelelektrophorese.- 1.1.5 Proteinbestimmung mit Amidoschwarz.- 1.1.6 Mikro-Biuret-Methode.- 1.1.7 Proteinbestimmung durch UV-Messung.- 1.2 Quantitative Nukleinsäurebestimmungen.- 1.2.1 DNS-, RNS- und Proteintrennungsgang nach Schmidt und Thannhauser.- 1.2.2 RNS-Bestimmung mit Orcin.- 1.2.3 DNS-Bestimmung mit Diphenylamin.- 1.2.4 DNS- bzw. RNS-Bestimmung in Gewebehomogenaten.- 1.2.5 Quantitative Nukleinsäurebestimmung durch UV-Messung.- 1.3 Quantitative Phosphatbestimmungen.- 1.3.1 Bestimmung von anorganischem Phosphat.- 1.3.2 Bestimmung von Gesamt-Phosphat.- 1.3.3 Phospholipid-Bestimmung.- 1.4 Monosaccharid-Bestimmung.- 2 Gelelektrophoretische Methoden.- 2.1 Elektrophoresesysteme.- 2.1.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach Laemmli.- 2.1.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach Weber, Pringle und Osborn.- 2.1.3 Harnstoff-SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese.- 2.1.4 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bei ph 2.4.- 2.1.5 Harnstoff- Polyacrylamid-Gelelektrophorese bei ph 2.- 2.1.6 Anodisches diskontinuierliches Polyacrylamid- Gelelektrophoresesystem.- 2.1.7 Kathodisches diskontinuierliches Polyacrylamid-Gelelektrophoresesystem.- 2.1.8 Zweidimensionale Polyacrylamid- Gelelektrophorese (O’Farrel-Technik).- 2.1.9 Nicht-denaturierende Nukleinsäure-Elektrophorese.- 2.1.10 Denaturierende Nukleinsäure-Elektrophorese.- 2.1.11 Identifizierung von Phosphoaminosäuren.- 2.2 Hilfsmittel für die Kontrolle der Elektrophorese.- 2.2.1 Markerfarbstoffe für die Kontrolle der Elektrophorese.- 2.2.2 Eichproteine für die Polyacrylamid- Gelelektrophorese.- 2.2.3 Kovalente Farbmarkierung von Eichproteinen.- 2.3 Färbemethoden.- 2.3.1 Proteinfärbung mit organischen Farbstoffen.- 2.3.2 Silberfärbung von Proteinen (Glutaraldehyd-Fixierung).- 2.3.3. Silberfärbung von Proteinen (Formaldehyd-Fixierung).- 2.3.4 Silberfärbung von Glycoproteinen und Polysacchariden.- 2.3.5 Abschwächen von silbergefärbten Gelen.- 2.3.6 Färbung von Proteinen auf Nitrocellulose mit Tusche.- 2.3.7 Färbung auf Nitrocellulose mit kolloidalem Gold.- 2.3.8 Färbung von Proteolipiden bzw. Lipiden und Lipoproteinen.- 2.3.9 Färbung von Glycoproteinen und Polysacchariden mit Schiff schem Reagenz (PAS staining).- 2.4 Elektroelution aus Gelen.- 2.4.1 Quantitative Elektroelution von Proteinen aus Polyacrylamid-Gelen und Entfernung von SDS.- 2.4.2 Elektrotransfer von Proteinen (Western blot).- 2.4.3 Immunochemischer Antigennachweis nach Elektrotransfer.- 2.4.4 Glycoprotein-Detektion nach Elektrotransfer.- 2.4.5 Transfer von Nucleinsäuren.- 2.5 Trocknung von Elektrophoresegelen.- 2.6 Autoradiographie von 3H- und 35S-markierten Verbindungen in Elektrophoresegelen.- 3 Chromatographische Methoden.- 3.1 Dünnschichtchromatographie (DC).- 3.1.1 Dünnschichtchromatographie von modifizierten Aminosäuren (Bestimmung der N-terminalen Aminosäure im Polypeptid).- 3.1.2 Trennung von Nukleosidphosphaten.- 3.1.3 Lipidextraktion und Dünnschichtchromatographie von Lipiden.- 3.2 Säulenchromatographie.- 3.2.1 Konzentrierung von Proteinlösungen.- 3.2.2. Praktische Hinweise zur Säulenchromatographie.- 3.2.3 Vorbehandlung von Ionenaustauscher- Materialien.- 3.3 Affinitätschromatographie.- 3.3.1 Bromcyanaktivierung von Polysaccharid-Chromatographieträgern.- 3.3.2 Kopplung an Bromcyan-aktivierte Gele.- 3.3.3 Kopplung von Reaktivfarbstoffen an Polysaccharide.- 3.3.4 Kovalente Bindung von Biotin (Biotin-Avidin/Streptavidin-System).- 4 Immunchemische Methoden.- 4.1 Heidelberger-Kurve.- 4.2 Doppelt-radiale Immunodiffusion nach Ouchterlony.- 4.3 Immunelektrophorese.- 4.4 Gegenstromelektrophorese.- 4.5 dot-blot-Test.- 4.6 Enzym-Immunosorbent-Test (EIA bzw. ELISA).- 4.7 Meerrettichperoxidase-Immunoglobulin-Konjugat(Glutaraldehyd-Methode).- 4.8 Alkalische-Phosphatase-Immunoglobulin- Konjugat (Glutaraldehyd-Methode).- 4.9 Protein-kolloidales-Gold-Komplex.- 5 Ultrazentrifugation.- 5.1 Differentialzentrifugation.- 5.2 Dichtegradientenzentrifugation.- 5.2.1 Stufengradientenzentrifugation.- 5.2.2 Saccharosegradientenzentrifugation.- 5.2.3 Isopyknische Zentrifugation.- 5.3 Drehzahl-Zentrifugalbeschleunigungs-Nomogramme.- 6 Nukleinsäure-Sequenzanalyse (V. Hahn).- 6.1 DNS-Sequenzanalyse.- 6.1.1 Chemisches Sequenzierungsverfahren (Maxam-Gilbert- Verfahren).- 6.1.2 Enzymatisches Sequenzierungsverfahren (Sanger-Technik), Prinzip der basenspezifisch beendeten Synthese (Kettentermination).- 6.2 RNS-Sequenzanalyse.- 6.2.1 Markierung der RNS.- 6.2.2 Sequenzierung der RNS mittels basenspezifischer chemischer Spaltung.- 6.2.3 Sequenzierung durch basenspezifische enzymatische Spaltung.- 6.2.4 Basenspezifische chemische Spaltung von RNS an einem Träger (Festphasen-Sequenzanalyse).- 7 Markierung mit radioaktiven Isotopen.- 7.1 [32P]-Phosphatinkorporation in Proteine.- 7.2 Iodierung mit 125I-Iodverbindungen.- 7.3 Radioaktiver Zerfall.- 7.4 Zerfallstabellen für Phosphor-32, Schwefel-35 und Iod-125.- 7.5 Szintillator-Lösungen für die Flüssigszintillationsmessung.- 8 Puffersysteme und pH-Wert.- 8.1 pk-Werte und Molmassen von Puffersubstanzen.- 8.2 Diagramm zur Pufferberechnung.- 8.3 pH-Farbindikatoren.- 8.4 Nomogramm zur Herstellung von Phosphatpuffern mit definierter Ionenstärke.- 8.5 Pufferlösungen.- 8.6 pH-Eichpuffer.- 9 Reinigungsvorschriften für ausgewählte Laborchemikalien.- 10 Tabellen.- 10.1 Konzentrationsmaße.- 10.2 Umrechnung SI-fremder Maßeinheiten in SI-Einheiten.- 10.3 Molmassen häufig verwendeter Substanzen.- 10.4 Molmassen und isoelektrischer Punkt von Proteinen.- 10.5 Absorptionskoeffizienten von Proteinen.- 10.6 Aminosäure-Einbuchstabencode und Molmassen von Aminosäuren.- 10.7 Spektroskopische Daten von Nukleotiden.- 10.8 Stoffwerte von Detergenzien (Tensiden).- 10.9 Brechungsindex und Dichte von Saccharose-Lösungen.- 10.10 Ammoniumsulfat-Tabelle.- 10.11 Angaben zur Herstellung verdünnter Lösungen.- 11 Anhang.- 11.1 Statistische Formeln.- 11.2 BASIC-Programme.- 12 Sachverzeichnis.