Hemmung der Expression von porzinen endogenen Retroviren (PERVs) mittels RNA-Interferenz

ISBN-13: 9783640585212 / Niemiecki / Miękka / 2010 / 108 str.

Christoph Kruse

Opis

Diplomarbeit aus dem Jahr 2009 im Fachbereich Biologie - Mikrobiologie, Molekularbiologie, Note: 1,3, Universitat Potsdam (Robert Koch-Institut), Sprache: Deutsch, Abstract: Die Xenotransplantation vom Schwein auf den Menschen ist mit dem Risiko der Ubertragung von porzinen endogenen Retroviren (PERVs) verbunden, die im Genom jeder Zelle des Schweins integriert sind und sich nicht durch DPF-(designated pathogen free) Zucht eliminieren lassen. PERVs infizieren humane Zellen in vitro, womit die Moglichkeit einer in vivo Infektion des humanen immunsuppremierten Rezipienten nicht ausgeschlossen werden kann. In den letzten Jahren wurde deshalb nach Moglichkeiten gesucht, die Ubertragung zu verhindern. Die RNA-Interferenz stellt hierbei eine vielversprechende Strategie dar, da sie die Replikation von PERV posttranskriptional unterbinden kann. So gelang es, transgene Schweine zu generieren, die in der Lage waren, shRNAs stabil zu exprimieren. In isolierten primaren Fibroblasten der transgenen Schweine wurde das fluoreszierende GFP mittels Fluoreszenzmikroskopie sowie die Integration des Transgens mittels PCR nachgewiesen, indem zum einen das gfp-Gen und der verwendete lentivirale Vektor, als auch die Expressionskassette der shRNA detektiert wurden. Alle entnommenen primaren Fibroblasten enthielten Proviren der Subtypen A, B und C, die mittels PCR nachgewiesen wurden. Zudem konnte die Expression der Volllangen-mRNA sowie gespleiter env-mRNA mittels RT-PCR gezeigt werden. Um die Sensitivitat der Nachweismethoden der PERV-Expression zu erhohen, wurde eine neue one-step RT real-time PCR unter Verwendung neuer Primer und Sonde etabliert. Dadurch konnte eine verbesserte Detektion der shRNA-induzierten Hemmung der PERV-Expression um bis zu 93 % anstelle fruherer 70 % nachgewiesen werden. Um die Effektivitat der RNA-Interferenz weiter zu erhohen, wurden neue PERV-mRNA-spezifische shRNAs generiert und mit der bisher verwendeten shRNA zu Tandems kombiniert. Nach der Klonierung der