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Das Bacterial Two Hybrid System
ISBN-13: 9783639495669 / Niemiecki / Miękka / 2014 / 88 str.
Das Bacterial Two Hybrid System, welches 1998 von Karimova et al. entwickelt wurde ist eine einfache Methode, die in vivo Screening und Selektion funktioneller Interaktionen bakterieller Proteine ermoglicht. Das allgemeine Prinzip beruht auf der funktionellen Komplementation zweier Fragmente aus der katalytischen Domane der Adenylatzyklase, einem Enzym, welches zyklisches AMP (cAMP) aus AMP synthetisiert. Im Fall eines funktionell intakten Enzymes bildet das synthetisierte cAMP einen Komplex mit dem sogenannten CAP-Protein aus und fuhrt als solches zur Induktion des Laktose-Operons. Die Fragmente T18 und T25 der katalytischen Domane liegen in zwei Vektoren vor, in welche die Sequenzen der auf Interaktion zu analysierenden Proteine kloniert werden. Eine Interaktion bringt die funktionell voneinander abhangigen Fragmente in raumliche Nahe, was zur Ausubung der Enzymfunktion ausreicht. Beim eingesetzten Klonierstamm fur das BTH-System handelt es sich um E.coli BTH101, welcher Adenylatzyklase-defizient ist. Eine Komplementation des Defizites durch Protein-Interaktionen fuhrt zur Laktose-Verwertung in den Zellen, was durch einen Farbumschlag auf Indikatormedium verfolgt werden kann. Entsprechend kann eine Aussage uber putativ bestehende Interaktionen getroffen werden.
Das Bacterial Two Hybrid System, welches 1998 von Karimova et al. entwickelt wurde ist eine einfache Methode, die in vivo Screening und Selektion funktioneller Interaktionen bakterieller Proteine ermöglicht. Das allgemeine Prinzip beruht auf der funktionellen Komplementation zweier Fragmente aus der katalytischen Domäne der Adenylatzyklase, einem Enzym, welches zyklisches AMP (cAMP) aus AMP synthetisiert. Im Fall eines funktionell intakten Enzymes bildet das synthetisierte cAMP einen Komplex mit dem sogenannten CAP-Protein aus und führt als solches zur Induktion des Laktose-Operons. Die Fragmente T18 und T25 der katalytischen Domäne liegen in zwei Vektoren vor, in welche die Sequenzen der auf Interaktion zu analysierenden Proteine kloniert werden. Eine Interaktion bringt die funktionell voneinander abhängigen Fragmente in räumliche Nähe, was zur Ausübung der Enzymfunktion ausreicht. Beim eingesetzten Klonierstamm für das BTH-System handelt es sich um E.coli BTH101, welcher Adenylatzyklase-defizient ist. Eine Komplementation des Defizites durch Protein-Interaktionen führt zur Laktose-Verwertung in den Zellen, was durch einen Farbumschlag auf Indikatormedium verfolgt werden kann. Entsprechend kann eine Aussage über putativ bestehende Interaktionen getroffen werden.
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